在定量PCR（也稱rt-PCR或qPCR）中，熒光信號是由熒光探針或熒光DNA結(jié)合染料（如SYBR Green）產(chǎn)生，其強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物分子（擴(kuò)增子）的數(shù)量成正比。每個循環(huán)結(jié)束時，收集熒光信號強(qiáng)度，通過將熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖，qPCR儀生成擴(kuò)增曲線，其表示在整個PCR過程中產(chǎn)物的累積，通過這個過程，即可實現(xiàn)量化。如果樣品中特定的序列（DNA或RNA）豐富，則在較早的循環(huán)中觀察到擴(kuò)增，Ct值小;如果序列稀少，則在稍后的循環(huán)中觀察到擴(kuò)增，Ct值大。此SOP將涵蓋總RNA提取和兩步法逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（qRT PCR）的操作過程以及數(shù)據(jù)分析。
注意事項:
1、 所有步驟均應(yīng)在超凈工作臺上進(jìn)行，超凈臺紫外照射至少15min。
2、所有試劑應(yīng)為此實驗專用。
3、使用75％乙醇或其他去污劑擦拭工作臺，避免表面污染。
4、 進(jìn)入熒光定量PCR 操作實驗室后需要佩戴一次性無菌口罩、無菌乳膠手套、實驗中盡量避免與同事交談，防止PCR 模板污染。
5、實驗中使用各種規(guī)格的離心管，槍頭及配制試劑和溶解沉淀用的水，均應(yīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。
6、 使用Trizol試劑時，避免接觸皮膚或衣服。避免吸入蒸氣。
7、qPCR反應(yīng)需要qPCR級水，試劑和試管。請務(wù)必使用正確類型的qPCR光學(xué)PCR管和蓋子。不可用普通的PCR管。
8、加樣前，先布局，規(guī)劃加樣順序以避免交叉污染。
9、所有實驗應(yīng)均應(yīng)設(shè)置無模板對照，其中包含除DNA或cDNA樣品以外的所有反應(yīng)組分。
10、先配制qPCR反應(yīng)混合液，減少誤差。
11、 加樣后上機(jī)前，務(wù)必通過瞬離將反應(yīng)液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因為氣泡會干擾熒光檢測且降低酶活性，從而降低擴(kuò)增效率。
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