PCR鑒定試劑盒原理是由一對引物介導(dǎo),能在動(dòng)植物體外對特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增,經(jīng)過n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0<E<1,擴(kuò)增效率=倍,使得檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
PCR鑒定試劑盒的使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。
1、標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
2、用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR模板稀釋液,*用帶芯槍頭,下同)。
3、在7號管中加入5μL陽性對照(濃度為1×10E8拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4、換槍頭,在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5、換槍頭,在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6、重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7、用自選方法純化樣品的DNA,本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8、如果有N個(gè)樣品,則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取,多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
9、如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對照(用水做模板),6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對照(用水做模板),1個(gè)用于PCR陽性對照。