不同的實驗方法需要不同的抗體特性，因為抗原以不同的方式呈現(xiàn)。在變性SDS-PAGE 后，抗原可能是蛋白質(zhì)印跡檢測中呈線性的氨基酸序列，或者在細胞免疫分離、免疫沉淀或基于 ELISA 的方法中整體是天然結(jié)構(gòu)。在免疫染色中，必須檢測固定細胞或組織中的交聯(lián)、化學(xué)修飾結(jié)構(gòu)。這意味著一種抗體可能在一種應(yīng)用中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，但在另一種應(yīng)用中卻不適用。這也意味著一種檢測的特異性并不能保證在不同應(yīng)用中的特異性。必須對所有應(yīng)用程序獨立進行驗證。下面詳述下抗體驗證的八種方法：
1. 省略一抗
這是測試由二級試劑引起的潛在背景的有用且重要的控制。然而，這個實驗沒有提供關(guān)于一抗質(zhì)量的信息。
2.抗體信號與文獻數(shù)據(jù)一致
WB 中觀察到的分子量、組織分布和染色模式與文獻一致。這種驗證方法很容易執(zhí)行，但也有一些限制；例如，WB 中條帶的正確分子量并不一定會告訴您該條帶是所需的目標蛋白質(zhì)。在 WB 中很容易有數(shù)百種蛋白質(zhì)以相同的速度運行，這可能會導(dǎo)致對結(jié)果的誤解。文獻中的數(shù)據(jù)也可能不正確或不完整。
3. 轉(zhuǎn)染細胞以過表達靶抗原
在表現(xiàn)出弱內(nèi)源性表達或無內(nèi)源性表達的細胞系中，過表達靶蛋白可以給出抗體特異性和敏感性的問題。通過這種方法可以很容易地評估與同一蛋白質(zhì)的不同亞型的反應(yīng)性。然而，人為的高水平靶蛋白通常不能反映內(nèi)源性表達水平。組織或細胞裂解物中預(yù)期大小或定位的干凈信號，已知含有目的蛋白質(zhì)，結(jié)合過表達系統(tǒng)中的陽性結(jié)果，是特異性的良好指標。
4.用免疫原阻斷/預(yù)吸附抗體
特別是對于多克隆血清，這是確定觀察到的信號是否與免疫抗原相關(guān)的有用實驗。如果信號在預(yù)吸附后消失，則該信號很有可能是特異性的。然而，不能排除與共享類似抗體結(jié)合表位的其他蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性（可在此處找到建議的預(yù)吸附方案）。
5.KO細胞或組織
KO(Knock-out)敲除測試抗體特異性的金標準。與野生型相比，KO中的信號丟失是特異性的zui可靠證據(jù)。請記住，在蛋白質(zhì)印跡中成功的KO驗證并不能保證在其他應(yīng)用（如免疫染色）中的特異性。不幸的是，KO細胞或組織并不總是可用的。
6.KD-細胞或組織
KD(Knock-down)目標的敲低也可以告訴您很多關(guān)于抗體特異性的信息。與KO相比，通過 RNAi下調(diào)蛋白質(zhì)通常更快、更容易完成。根據(jù)降低的mRNA水平，與對照系統(tǒng)相比，KD模型中的信號或染色應(yīng)減少。有時KD不是很有效，結(jié)果的解釋可能很困難。
7.IP或ELISA應(yīng)用的IP/MS驗證
免疫沉淀 (IP)以及隨后通過質(zhì)譜(MS)進行的蛋白質(zhì)鑒定是分析IP或ELISA應(yīng)用的抗體特異性的強大工具。然而，這種方法并沒有告訴您很多關(guān)于其他應(yīng)用（如蛋白質(zhì)印跡或免疫染色）中抗體特異性的信息。
8.針對同一目標不同表位的抗體
這種驗證方法可以提供有關(guān)抗體特異性的寶貴數(shù)據(jù)，尤其是在免疫染色或蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用中。用針對同一目標但具有不同表位的抗體獲得的匹配染色模式為其特異性提供了很好的證據(jù)。結(jié)合靶蛋白不同部分的不同抗體不太可能具有相同的非特異性結(jié)合配偶體。
總結(jié)：
如果你有 KO 模型，則抗體的驗證非常簡單明了。如果這個黃金標準不可用，則必須收集盡可能多的關(guān)于目標和抗體本身的信息和驗證數(shù)據(jù)，以產(chǎn)生高概率的特異性。
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